KO小鼠模型構(gòu)建方法及應(yīng)用

1. 構(gòu)建方法

傳統(tǒng)同源重組技術(shù)：通過在胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）中引入目標(biāo)基因的突變，并插入選擇性標(biāo)記基因（如抗性基因）來失活目標(biāo)基因。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是精確度高，但構(gòu)建過程較為復(fù)雜，周期較長。

基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究人員可以在受精卵或胚胎階段快速實(shí)現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)基因的敲除。CRISPR/Cas9技術(shù)具有操作簡單、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已成為構(gòu)建KO小鼠模型的主流方法。

顯微注射法：將CRISPR/Cas9系統(tǒng)組分（如Cas9蛋白、gRNA）通過顯微注射的方式注入小鼠受精卵的原核或細(xì)胞質(zhì)中，然后將編輯后的受精卵移植到代孕母鼠體內(nèi)。

電穿孔法：通過電脈沖將CRISPR/Cas9系統(tǒng)組分導(dǎo)入受精卵或胚胎細(xì)胞中，提高基因編輯的效率。

2. 基因型鑒定

PCR鑒定：利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以快速鑒定KO小鼠。這種方法適用于初步篩選轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。

Southern blotting：通過限制性酶切和探針雜交來檢測KO小鼠的基因整合情況和拷貝數(shù)。這種方法可以提供關(guān)于基因整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)的詳細(xì)信息。

3. 應(yīng)用

疾病模型構(gòu)建：KO小鼠模型被廣泛用于模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展，研究基因在疾病中的生物學(xué)功能。例如，通過敲除腫瘤抑制基因Tp53，能夠構(gòu)建小鼠腫瘤模型，幫助研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

基因功能研究：通過敲除特定基因，可以研究其在細(xì)胞發(fā)育、免疫反應(yīng)、代謝等方面的作用，在基因功能解析和疾病機(jī)制研究中占據(jù)重要地位。

藥物篩選和驗(yàn)證：KO小鼠模型可用于藥物篩選和驗(yàn)證，評估藥物的療效和安全性，幫助驗(yàn)證治療靶點(diǎn)的有效性，促進(jìn)新藥的研發(fā)。

實(shí)例

Pcoke2-null小鼠模型：通過將Pcoke2基因的大部分外顯子3替換為IREs-laz/新mei素抗性盒來生成Pcoke2-null胚胎。將胚胎注入C57BL/6雌性小鼠體內(nèi)，后代與C57BL/6小鼠交配，產(chǎn)生野生型（WT）和Pcoke2-null（KO）小鼠。

ACE2基因敲除小鼠模型：多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)利用傳統(tǒng)同源重組、TALEN技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了ACE2基因敲除（KO）小鼠模型。這些模型在研究ACE2的生物學(xué)功能病理機(jī)制中具有重要價(jià)值。